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目前，新冠疫情仍在全球蔓延，并導致超過(guò)650萬(wàn)例感染死亡病例。以Beta、Gamma、Delta和Omicron為代表的SARS-CoV-2變異株頻繁出現，或因更強的傳播性、致病性和免疫逃避能力，使得疫苗接種等預防措施難以阻斷COVID-19大流行病的持續爆發(fā)。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)高效的能夠快速識別病毒變種的方法及相關(guān)器件。相比傳統的RT-qPCR 等檢測方法，基于二維（2D）材料的場(chǎng)效應晶體管（FET）生物傳感器因其超高靈敏、快速實(shí)時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，受到了廣泛關(guān)注。然而，如何進(jìn)一步提高晶體管傳感器的精確感知能力，使其能夠識別核酸分子內部關(guān)鍵信息、特別是單堿基變異，是實(shí)現新冠病毒變異株分型的關(guān)鍵。
近日，南京理工大學(xué)曾海波&陳翔教授團隊探索和研究了二維硒化銦（2D InSe）FET對SARS-CoV-2變異核酸序列的識別能力。首先，原子層沉積（ALD）氧化鋁保證了2D InSe FET的遷移率和穩定性，使器件對目標核酸實(shí)現了亞飛摩爾級（sub-fM）的檢測限，濃度線(xiàn)性響應范圍達到6個(gè)數量級（10-14~10-8 M）。其次，器件可以在15分鐘內識別出單核苷酸變異（SNVs）的類(lèi)型與位置（p < 0.01），從而直接快速分辨出Delta基因組中的兩個(gè)核心突變（L452R, R203M）。該性能主要歸功于沉積氧化鋁后，2D InSe發(fā)生了淺層氧取代（InSe1-xOx）。后者在2D InSe中引入的陷阱態(tài)（Traps）對核酸負電荷信號敏感并參與載流子輸運，引起2D InSe FET超靈敏的電信號變化。該研究實(shí)現了病毒檢測、變異診斷與預警的一體式傳感，對后疫情時(shí)代各類(lèi)高傳染、易突變病毒的早期篩查具有重要的意義。 采用機械剝離，從塊體InSe單晶中獲得厚度為6~10 nm的2D InSe納米片，以作為場(chǎng)效應晶體管的溝道材料。在制作源/漏電極前后，Al2O3分兩次沉積到2D InSe表面，之后旋涂PMMA保護器件。為實(shí)現2D InSe FET的傳感功能，通過(guò)電子束曝光（EBL）去除溝道上的PMMA，使得溝道上方可以正常進(jìn)行探針?lè )跤秃怂釞z測。穩定性測試表明，Al2O3層有效提高了FET器件在磷酸鹽緩沖鹽水（0.01× PBS）中的穩定性。在PBS中浸泡48 h后，FET器件的開(kāi)態(tài)電流仍高達初始電流值的73.5%，遷移率也無(wú)明顯下降（> 10 cm2·V-1·s-1），完全滿(mǎn)足探針固定（36 h）和在PBS中傳感的器件穩定性要求。 當通過(guò)該FET檢測核酸時(shí)，核酸的磷酸鹽骨架會(huì )在緩沖鹽水中發(fā)生電離從而表現為負電荷。目標核酸被FET表面的探針捕獲后，會(huì )在溝道上形成等效負柵極電壓。這導致n型InSe半導體的費米能級（EF）向下移動(dòng)，降低了電子的遷移率和密度，從而使得源/漏電流降低。為了更好的反映核酸形成的等效負柵極電壓，我們定義了器件的校準響應為： 
實(shí)驗結果表明，10~15分鐘后，2D InSe FET的對核酸的響應趨于穩定，且具有較寬的線(xiàn)性工作范圍（10-14~10-8 M）。根據擬合結果，2D InSe FET對DNA和RNA的檢測極限分別為0.71 fM和0.79 fM。同時(shí)，開(kāi)爾文探針力顯微鏡（KPFM）的表征也證明，DNA和RNA可以在溝道上方形成不同的等效負電勢，分別為-154 mV和-111 mV。 
圖1. 二維InSe晶體管用于快速超靈敏檢測SARS-CoV-2。2D InSe FET結構示意圖(A)和實(shí)物光鏡圖像(B)。(C) 2D InSe FET穩定性試驗（PBS溶液中）。(D) PBS中器件的開(kāi)態(tài)電流（歸一化）和遷移率隨時(shí)間變化。2D InSe FET對目標DNA (E)和RNA (F)序列的濃度傳感實(shí)驗。(G,H) FET對互補核酸序列（未突變）的校準響應(?Vcal)。(I)對不同濃度互補序列的線(xiàn)性響應范圍。通過(guò)KPFM檢測到的DNA (K)或RNA (L)雜交前后(J)的表面電位變化和對應的能帶示意圖。 多種堿基類(lèi)型的單核苷酸突變在SARS-CoV-2變異株中很常見(jiàn)。例如，R203M和R203K分別是Delta和Gamma變異株的特征同位突變，它們具有不同的核苷酸錯配類(lèi)型，但位于相同的位置。此外，突變核苷酸的位置也是重要的信息。例如，在Delta、Beta和Gamma中都存在D614G突變，這意味著(zhù)出現D614G的位置可以成為快速識別變異株的通用測序點(diǎn)。在這兩方面，2D InSe FET表現出優(yōu)異的識別能力。在40℃下，FET對C-C、C-T 和C-A三類(lèi)不同堿基類(lèi)型突變均有不同相應，且與互補序列顯著(zhù)區分。而通過(guò)調整工作溫度，FET可以在60℃下實(shí)現對不同突變位置序列的區分，空間分辨率約為七個(gè)堿基間隔。2D InSe FET的響應與高分辨熔解曲線(xiàn)（HRM）高度吻合，后者可以獨立分析核酸序列在溶液體系的穩定狀態(tài)，用于驗證2D InSe FET響應的可靠性?；趯ν蛔儔A基類(lèi)型和位置的良好分辨率，2D InSe FET可實(shí)現對Delta關(guān)鍵突變：R203M（N）和L452R（S）快速識別（單因素方差分析：???p?<?.001）。 
圖2. 利用2D InSe FET直接識別SARS-CoV-2 單核苷酸突變（SNVs）。(A) 不同SARS-CoV-2變異株對應的高頻突變示意圖。(B) FET對DNA上同一位置、不同類(lèi)型的單堿基對突變的時(shí)間依賴(lài)性響應（ORF1ab區域）。(C) 不同堿基突變類(lèi)型ORF1ab序列的HRM分析。(D) 比較FET的平均校準響應和熔解溫度Tm，用于驗證識別不同堿基類(lèi)型突變的可行性。(E) 不同單堿基突變位置的HRM分析。(F) HRM中定義的熔解溫度Td顯示第21位、第13位和第6位突變的核酸序列顯著(zhù)不同。(G) FET對不同突變位置核酸的平均校準響應與HRM分析結果高度一致。(H) 對兩種Delta關(guān)鍵突變：R203M（N）和L452R（S）的HRM分析。(I) 60℃下對R203M突變的FET校準響應。(J) 40℃下對L452R突變的FET校準響應。 經(jīng)過(guò)兩步ALD工藝，在2D InSe FET上構建了一層Al2O3薄膜作為保護層。拉曼光譜顯示ALD后的InSe在309 cm-1處增加了對應于In-O振動(dòng)的Ag模式，表明了InSe1-xOx的形成。x射線(xiàn)光電子能譜（XPS）的結果為InSe1-xOx的存在，提供了另一個(gè)有力的證據。在Se 3d和In 3d結合能剖面上，可以明顯觀(guān)察到峰的展寬和偏移，這主要是由于電子從未氧化層（InSe）轉移到氧取代層（InSe1-xOx）。為了驗證InSe氧化的影響以及隨后傳感能力的提高，本研究在DFT框架下計算原始2D InSe和2D InSe1-xOx的能帶結構和態(tài)密度（DOS）。由于O原子對In原子p軌道的影響，In-p主導的InSe導帶發(fā)生了明顯的變化，具體表現為帶隙變窄（1.52 → 0.36 eV）和從間接帶隙向直接帶隙轉變。在O原子取代后，DOS曲線(xiàn)顯示了InSe1-xOx在InSe的導帶和價(jià)帶之間形成的局域態(tài)，其中對應的能級作為捕獲載流子的陷阱態(tài)。 
圖3. 二維InSe晶體管的突變識別機制。(A) 原始2D InSe和ALD-Al2O3工藝后的InSe原位光鏡圖像。(B)原始InSe和InSe1-xOx（ALD后）的拉曼光譜。(C)原始InSe和InSe1-xOx的XPS能譜。(D) 具有六方結構和D3h對稱(chēng)性的InSe晶體以及晶胞中Se空位發(fā)生O取代的InSe1-xOx。(E,F) InSe和InSe1-xOx的能帶結構。(G) 原始2D InSe和InSe1-xOx的DOS模擬結果。(H) InSe1-xOx中陷阱態(tài)誘導的載流子輸運的示意圖。 當柵極電壓偏置為正時(shí)，根據多陷阱捕獲和釋放（MTR）模型，電子可以占據局域態(tài)之間的淺陷阱態(tài)。根據熱力學(xué)阿倫尼烏斯（Arrhenius）模型和變程跳躍（VRH）模型，填充在陷阱態(tài)的電子跳躍輸運行為占主導地位。因此，在2D InSe FET 生物傳感器中，需要給出如下陷阱態(tài)載流子濃度的變化（Δnt）的公式，以分析陷阱態(tài)的作用： 
其中，n0為導帶平衡載流子濃度，Nc為導帶有效態(tài)密度，Nt為陷阱態(tài)密度，Et為陷阱態(tài)能級，k0為玻爾茲曼常數，T為溫度。當目標核酸產(chǎn)生的負表面電位導致InSe費米能級出現一個(gè)微小的向下偏移時(shí)：ΔEF ? Ec-EF，此時(shí)n0可以看成是一個(gè)常數。即在帶傳輸機制下，核苷酸突變的變化太微弱而難以影響溝道的載流子輸運。然而隨著(zhù)陷阱態(tài)的參與，在式（2）中ΔEF 的值相對Et-EF是不可忽略的，因為Et 能級的位置遠比Ec更接近EF。因此負電勢可以有效的限制電子填充陷阱，抑制電子跳躍傳輸。最終通過(guò)式（1）進(jìn)一步放大這種填充抑制的效果，引起更多的電流下降，即實(shí)現了傳感信號的增強。 綜上所述，本文開(kāi)發(fā)了一種支持直接快速識別SARS-CoV-2變異株的2D InSe FET，通過(guò)兩步ALD過(guò)程保證了器件良好的穩定性和靈敏度。該FET生物傳感器具有較寬的濃度檢測范圍（10-14~10-8 M），對DNA （0.71 fM）和RNA （0.79 fM）均具有超低的檢測限。此外，該設備具有識別SARS-CoV-2單核苷酸突變的的關(guān)鍵能力（ORF1ab），包括在三個(gè)獨立位置的不同堿基突變類(lèi)型（p?<?0.05）。根據校準響應的顯著(zhù)差異，該器件可以直接識別出Delta變異株的兩個(gè)核心突變（L452R和R203M）。其中陷阱態(tài)在核酸傳感中起積極作用，提高了載流子傳輸對核酸等效負電勢的敏感度。該2D InSe FET為SARS-CoV-2 變異株的早期篩查、診斷和及時(shí)數據采集提供了一種新策略，有望對病毒的隱性傳播進(jìn)行有效預警，以指導公共衛生干預措施。
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